pengecatan gram

Pengecatan Gram merupakan salah satu teknik pengecatan yang dikerjakan di laboratorium mikrobiologi untuk kepentingan identifikasi mikroorganisme. Morfologi mikroskopik mikroorganisme yang diperiksa dan sifatnya yang khas terhadap pengecatan tertentu (pengecatan Gram) dapat digunakan untuk identifikasi awal. Pemeriksaan ini dapat dilakukan dengan cepat dan biaya murah serta, dalam kasus tertentu, dapat membantu dokter untuk memulai terapi suatu penyakit tanpa menunggu hasil kultur.

Metode pengecatan tersebut pertama kali ditemukan oleh Christian Gram pada tahun 1884. Dengan metode pengecatan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya. Oleh karena itu, pengecatan Gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp.

PERSIAPAN

Sebelum dilakukan pengecatan Gram, tentu harus disiapkan bahan (spesimen) yang akan diperiksa. Bahan yang akan diperiksa, dapat berasal dari : 1) langsung dari penderita dapat berupa sputum (dahak), pus (nanah), discharge telinga, discharge hidung, urin dan cairan serebrospinal.

Spesimen yang akan dicat, sebelumnya dibuat sediaan atau preparat (smear) terlebih dulu. Pengertian preparat adalah sampel spesimen yang diletakkan atau dioleskan pada permukaan gelas obyek (object glass) atau slides, dengan atau tanpa pewarnaan, yang selanjutnya dapat diamati di bawah mikroskop.

a. Pembuatan preparat

Alat dan bahan yang diperlukan adalah :

Alat :

1. Ose atau kapas lidi steril
2. Gelas obyek
3. Lampu spiritus

Bahan :

• Bahan yang akan diperiksa.

Untuk bahan yang berbeda, memerlukan cara pembuatan preparat yang berbeda pula. Berikut cara pembuatan preparat untuk berbagai sumber bahan.

a.1. Bahan langsung dari penderita

Bahan disentrifuge terlebih dulu, kemudian endapannya dibuat preparat. Bahan yang berupa endapan (pellet) hasil sentrifuge tersebut diambil dengan ose steril atau kapas lidi steril kemudian digoreskan pada gelas obyek setipis mungkin. Panaskan gelas obyek di atas nyala api lampu spiritus sambil diayunkan secukupnya (jarak preparat sampai nyala api kira-kira 20 cm), sampai preparat tersebut kering. Setelah kering, teteskan formalin 1 % tunggu selama 5 menit dan keringkan sekali lagi. Setelah betul-betul kering, preparat siap dicat.

a.2. Bahan dari biakan cair

Ambil gelas obyek yang bersih dan steril, bebaskan dari lemak dengan memanaskan di atas nyala api spiritus. Ambil kuman dari biakan cair (yang sebelumnya telah diaduk secara steril) dengan menggunakan ose steril, ratakan pada gelas obyek sehingga membentuk diameter kira-kira 1-2 cm. Preparat yang sudah dibuat kemudian dikeringkan dan ditetesi formalin dengan cara seperti pembuatan preparat langsung.

a.3. Bahan dari media pertumbuhan padat

Ambil gelas obyek yang bersih dan steril, bebaskan dari lemak dengan memanaskan di atas nyala api spiritus. Teteskan satu ose kaldu atau NaCl pada gelas obyek tersebut. Dengan ose steril, ambil satu koloni kuman dan ratakan pada gelas obyek sehingga membentuk diameter 1 – 2 cm, campur dengan kaldu tadi sampai homogen kemudian tipiskan. Selanjutnya dikerjakan sebagaimana membuat preparat dengan bahan berasal dari penderita.

Prinsip yang selalu harus diingat dan dipatuhi adalah :

• Selalu mensterilkan ose, pada saat akan dipakai dan setelah dipakai.
• Letakkan ose pada tempatnya, jangan diletakkan di sembarang tempat (misal di atas meja)
• Jangan memegang mata (ujung) ose dengan tangan.
• Usahakan tidak banyak bicara pada saat kerja.

b. Cat Gram

Cat Gram yang digunakan terdiri dari 4 macam, yaitu cat Gram A, B, C dan D. Masing-masing mempunyai komposisi dan fungsi yang berbeda. Komposisi dan fungsi masing-masing cat Gram, adalah sebagai berikut :

1. Cat Gram A

Cat ini terdiri atas :

Kristal violet : 2 gram

Etil alkohol 95 : 20 ml

Ammonium oksalat : 0,8 gram

Akuades : 80 ml

Cat Gram A berwarna ungu (karena mengandung kristal violet). Cat Gram A merupakan cat primer yang akan memberi warna mikroorganisme target. Pada saat diberi cat ini, semua mikroorganisme akan berwarna ungu sesuai warna cat Gram A.

2. Cat Gram B

Cat ini terdiri atas :

Yodium : 1 gram

Kalium Yodida : 2 gram

Akuades : 300 ml

Cat Gram B berwarna coklat. Cat Gram B merupakan cat Mordan, yaitu cat atau bahan kimia yang berfungsi memfiksasi cat primer yang diserap mikroorganisme target. Akibat pemberian cat Gram B, maka pengikatan warna oleh bakteri akan lebih baik (lebih kuat).

3. Cat Gram C

Cat ini terdiri atas :

Aseton : 50 ml

Etil alkohol 95 % : 50 ml

Cat Gram C tidak berwarna. Cat ini berfungsi untuk melunturkan cat sebelumnya. Akibat pemberian cat C akan terjadi 2 kemungkinan :

§ Mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu, karena tahan terhadap alkohol. Ikatan antara cat dengan bakteri tidak dilunturkan oleh alkohol. Bakteri yang bersifat demikian disebut bakteri Gram positif.

§ Bakteri akan tidak berwarna, karena tidak tahan terhadap alkohol. Ikatan antara cat dengan bakteri dilunturkan oleh alkohol. Bakteri yang bersifat demikian dikelompokkan sebagai bakteri Gram negatif.

4. Cat Gram D

Cat Gram D terdiri atas :

Safranin : 0,25 gram

Etil alkohol 95 % : 10 ml

Akuades : 90 ml

Cat ini berwarna merah. Cat ini merupakan cat sekunder atau kontras. Cat ini berfungsi untuk memberikan warna mikroorganisme non target. Cat sekunder mempunyai spektrum warna yang berbeda dari cat primer. Akibat pemberian cat Gram D, akan terjadi 2 kemungkinan :

• Bakteri Gram positif akan tetap berwarna ungu, karena telah jenuh mengikat cat Gram A sehingga tidak mampu lagi mengikat cat Gram D.
• Bakteri Gram negatif akan berwarna merah, karena cat sebelumnya telah dilunturkan oleh cat Gram C maka akan mampu mengikat cat Gram D.

Dasar teori cat Gram

Berdasarkan sifat terhadap cat Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi 2 yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif. Terdapat dua teori yang dapat menjelaskan dasar perbedaan ini yaitu :

1. Teori Salton

Teori ini berdasarkan kadar lipid yang tinggi (20 %) di dalam dinding sel bakteri Gram negatif. Zat lipid ini akan larut selama pencucian dengan alkohol. Pori-pori pada dinding sel membesar, sehingga zat warna yang sudah diserap mudah dilepaskan dan bakteri menjadi tidak berwarna.

Bakteri Gram positif mengalami denaturasi protein pada dinding selnya akibat pencucian dengan alkohol. Protein menjadi keras dan beku, pori-pori mengecil sehingga kompleks kristal yodium yang berwarna ungu dipertahankan dan bakteri akan tetap berwarna ungu.

2. Teori permeabilitas dinding sel

Teori ini berdasarkan tebal tipisnya lapisan peptidoglikan dalam dinding sel. Bakteri Gram positif mempunyai susunan dinding yang kompak dengan lapisan peptidoglikan yang terdiri dari 30 lapisan. Permeabilitas dinding sel kurang, dan kompleks kristal yodium tidak dapat keluar.

Bakteri Gram negatif mempunyai lapisan peptidoglikan yang tipis, hanya 1 – 2 lapisan dan susunan dinding selnya tidak kompak. Permeabilitas dinding sel lebih besar sehingga masih memungkinkan terlepasnya kompleks kristal yodium.

CARA PENGECATAN GRAM

Sebelum melakukan pengecatan Gram, siapkan alat dan bahan yang diperlukan.

Pastikan semua alat dan bahan yang diperlukan serta tempat untuk mencuci terletak di tempat yang terjangkau. Jangan sampai terlalu jauh sehingga menyulitkan dan memakan waktu.

Alat dan bahan yang diperlukan adalah :

Alat :

• Rak pengecatan
• Kran/sumber air yang mengalir

Bahan :

• Cat Gram A, B, C dan D
• Preparat yang telah siap untuk dicat

KELEBIHAN DAN KEKURANGAN PENGECATAN GRAM

Kelebihan :

1. Pengecatan Gram penting sebagai pedoman awal untuk memutuskan terapi antibiotik, sebelum tersedia bukti definitif bakteri penyebab infeksi (kultur dan tes kepekaan bakteri terhadap antibiotik). Hal ini karena bakteri Gram positif dan negatif mempunyai kepekaan yang berbeda terhadap berbagai jenis antibiotika.
2. Kadang-kadang morfologi bakteri yang telah dicat Gram mempunyai makna diagnostik. Misalnya pada pemeriksaan Gram ditemukan Gram negatif diplococci intraseluler dari spesimen pus (nana) uretral, maka memberikan presumptive diagnosis untuk penyakit infeksi gonore.

Kekurangan :

Pengecatan Gram memerlukan mikroorganisme dalam jumlah banyak yakni lebih dari 10⁴ per ml. Sampel yang cair dengan jumlah kecil mikroorganisme misalnya cairan serebrospinal, memerlukan prosedur sentrifuge dulu untuk mengkonsentrasikan mikroorganisme tersebut. Pellet (endapan hasil sentrifuge) kemudian dilakukan pengecatan untuk diperiksa secara mikroskopis.

Pustaka acuan :

Nirwati, Hera, _______, Pembuatan Preparat dan Pengecatan dalam Petunjuk Praktikum Mikrobiologi, Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta

Strohl, William A, Rouse,H, Fisher, BD, 2001, Lippincott’s Illustrated Reviews: Microbiology, Lippincott William & Wilkins, USA

koefisien fenol

Tujuan dari praktikum uji koefisien fenol adalah untuk mengevaluasi daya anti mikroba suatu desinfektan dengan memperkirakan potensi dan efektifitas desinfektan berdasarkan konsentrasi dan lamanya kontak terhadap kuman dan membandingkannya terhadap fenol standard yang disebut koefisien fenol.

Teori Dasar

Pengawasan terhadap mikroorganisme penyebab penyakit telah menjadi pemikiran para ahli semenjak penyakit-penyakit mulai dikenal. Berbagai macam substansi telah dicoba untuk memilih yang paling tepat guna menghilangkan pencemaran oleh jasad renik terhadap benda-benda baik hidup ataupun mati.

Bahan anti mikroba yang ditemukan memiliki keefektifan yang bermacam-macam, dan pengunaannya pun ditujukan terhadap hal-hal yang berbeda-beda pula. Salah satu jenis anti mikroba dikenal sebagai disinfektan, merupakan suatu zat (biasanya kimia) yang dipakai untuk maksud disinfeksi pada bahan-bahan tak bernyawa.

Fenol adalah salah satu contoh disinfektan yang efektif dalam membunuh kuman. Pada konsentrasi rendah, daya bunuhnya disebabkan karena fenol mempresipitasikan protein secara aktif, dan selain itu juga merusak membran sel dengan menurunkan tegangan permukaannya. Dengan persetujuan para ahli dan peneliti, fenol dijadikan standar pembanding untuk menentukan aktivitas sesuatu disinfektan.

Zat-zat antimikroba yang dipergunakan untuk disinfeksi harus diuji keefektifannua. Cara menentukan daya sterilisasi zat-zat tersebut adalah dengan melakukan tes koefisien fenol. Uji ini dilakukan untuk membandingkan aktivitas suatu produk (desinfektan) dengan daya bunuh fenol dalam kondisi tes yang sama. Berbagai pengenceran fenol dan produk yang dicoba dicampur dengan suatu volume tertentu biakan Salmonella thyphosa atau Staphylococcus aureus.

Prinsip Kerja

Pertumbuhan bakteri uji pada media yang sesuai setelah bakteri tersebut kontak dengan disinfektan dalam waktu 5, 10, dan 15 menit.
Alat dan Bahan

Alat:

* Tabung reaksi
* Ose/sengkelit
* Pencatat waktu (stopwatch)
* Mc Farland III (109 kuman/ml)
* Vortex
* Stiker label
* Spiritus

Bahan:

* Kaldu nutrisi (Nutrient Broth)
* Air suling steril
* Staphylococcus aureus ATCC 25953 dalam agar nutrisi (Gram +)
* Salmonella thyphosa ATCC 6539 dalam agar nutrisi (Gram -)­­­
* Larutan NaCl fisiologis 0,9%
* Fenol standar
* Desinfektan uji

Prosedur Kerja

1. Pembuatan media

Media kaldu nutrisi (Nutrient Broth) dimasukkan dalam 12 tabung reaksi ukuran 20 x 150 mm, volume masing-masing dibuat 5 ml. Komposisi perliter terdiri dari pepton 10 g, ekstrak daging 5 g, dan NaCl 5 g; pH akhir 6,8.


Pembuatan Inokulum

Bakteri Salmonella thyphosa atau Staphylococcus aureus sebelumnya telah ditanam pada agar nutrisi (Nutrient Agar) miring dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 24-48 jam.
Tahap pengenceran bakteri uji adalah sebagai berikut:

1. Siapkan tabung reaksi berisi 2 ml NaCl fisiologis 0,9%
2. Pindahkan biakan S. thyphosa atau S. aureus tersebut (pilih salah satu) ke dalam larutan NaCl dengan ose, dan setarakan kekeruhannya dengan larutan Mc Farland III (109 kuman/ml)
3. Suspensi kuman tersebut kini diperkirakan berisi 109 kuman/ml
4. Siapkan 3 buah tabung reaksi masing-masing berisi 4,5 ml NaCl fisiologis 0,9%
5. Pipet 0,5 ml dari suspensi kuman sebelumnya (109 kuman/ml), pindahkan ke salah satu tabung reaksi berisi 4,5 ml NaCl. Suspensi kuman kini berkonsentrasi 108 kuman/ml
6. Lakukan pengenceran kedua dengan mengambil 0,5 ml dari suspensi kuman 108 dan memindahkannya ke dalam tabung berisi 4,5 NaCl yang kedua. Suspensi kuman kini berkonsentrasi 107 kuman/ml
7. Pengenceran terakhir dilakukan dengan memindahkan 0,5 ml dari suspensi kuman 107 ke dalam tabung terakhir NaCl. Suspensi kuman telah setara dengan 106 kuman/ml. Suspensi bakteri dengan konsentrasi inilah yang akan digunakan untuk melakukan uji praktikum ini.

Pembuatan Larutan Baku Fenol

Dibuat larutan persediaan baku fenol 5% dengan cara menimbang 2,5 g fenol dalam 50 ml air suling steril. Kemudian dilakukan pengenceran konsentrasi menjadi 1:80 dengan mempipet 12,5 ml larutan fenol 5% ditambahkan dengan 37,5 ml air suling steril pada tabung steril ukuran 25 x 150 mm.

Pembuatan Larutan Disinfektan

Pengenceran larutan desinfektan dilakukan pada tabung steril berukuran 25 x 150 mm. Tahapannya adalah sebagai berikut:

1. Siapkan 4 buah tabung steril berisi aquades dengan volume yang berbeda-beda di dalamnya yaitu 9 ml, 7 ml, 4,5 ml, dan 7 ml, secara berurutan
2. Lakukan pengenceran pertama dengan mempipet 1 ml larutan desinfektan ke dalam 9 ml air suling sehingga konsentrasi menjadi 1:10
3. Pengenceran selanjutnya adalah dengan memindahkan 1 ml desinfektan 1:10 ke dalam tabung berisi 7 ml air suling. Konsentrasi desinfektan pada tabung ini adalah 1:80
4. Pindahkan 0,5 ml desinfektan 1:80 ke dalam 4,5 ml aquades sehingga konsentrasi kini 1:100
5. Pipet 0,5 ml desinfektan 1:100 ke dalam tabung berisi 7 ml air suling sehingga konsentrasi pada tabung ini adalah 1:150
6. Desinfektan yang akan dipakai selanjutnya adalah yang konsentrasinya 1:80, 1:100, dan 1:150. Oleh karena itu, samakan volumenya masing-masing menjadi 5 ml

Media, bakteri uji, larutan fenol, dan desinfektan telah disiapkan. Dengan demikian kita dapat melakukan inokulasi kuman uji dalam desinfektan dan fenol dengan memperhitungkan waktu kontak 5, 10, dan 15 menit secara akurat. Label 12 tabung berisi Nutrient both dengan menandai F5’, F10’, F15’, DES 1:80 5’, DES 1:80 10’, DES 1:80 15’, DES 1:100 5’, DES 1:100 10’, DES 1:100 15’, DES 1:150 5’, DES 1:150 10’, DES 1:150 15’.

* Uji Fenol

Pipet inokulum berkonsentrasi 106 kuman/ml sebanyak 0,5 ml ke dalam larutan fenol 1:80. Tunggu sampai 5 menit, ambil 1 ose dari campuran tersebut ke dalam tabung berlabel F5’. Lima menit kemudian, ambil lagi 1 ose dari campuran tersebut ke dalam tabung F10’. Setelah lima menit kemudian, ambil 1 ose dari campuran tersebut ke dalam tabung F15’.

* Uji I 1:80

Pipet inokulum berkonsentrasi 106 kuman/ml sebanyak 0,5 ml ke dalam desinfektan 1:80. Tunggu sampai 5 menit, ambil 1 ose dari campuran tersebut ke dalam tabung berlabel DES 1:80 5’. Lima menit kemudian, ambil lagi 1 ose dari campuran tersebut ke dalam tabung DES 1:80 10’. Setelah lima menit kemudian, ambil 1 ose dari campuran tersebut ke dalam tabung DES 1:80 15’.

* Uji II 1:100

Pipet inokulum berkonsentrasi 106 kuman/ml sebanyak 0,5 ml ke dalam desinfektan 1:100. Tunggu sampai 5 menit, ambil 1 ose dari campuran tersebut ke dalam tabung berlabel DES 1:100 5’. Lima menit kemudian, ambil lagi 1 ose dari campuran tersebut ke dalam tabung DES 1:100 10’. Setelah lima menit kemudian, ambil 1 ose dari campuran tersebut ke dalam tabung DES 1:100 15’.

* Uji III 1:150

Pipet inokulum berkonsentrasi 106 kuman/ml sebanyak 0,5 ml ke dalam desinfektan 1:150. Tunggu sampai 5 menit, ambil 1 ose dari campuran tersebut ke dalam tabung berlabel DES 1:150 5’. Lima menit kemudian, ambil lagi 1 ose dari campuran tersebut ke dalam tabung DES 1:150 10’. Setelah lima menit kemudian, ambil 1 ose dari campuran tersebut ke dalam tabung DES 1:150 15’.

Tabung-tabung reaksi uji kemudian dieramkan di dalam inkubator pada suhu 37°C selama 24-48 jam.
Diamati ada tidaknya pertumbuhan bakteri pada setiap tabung

Pengamatan cara inokulasi kuman ke dalam disinfectan :


(+) keruh : ada pertumbuhan
(-) jernih : tidak ada pertumbuhan

Hasil pengamatan

Setelah tabung reaksi diinkubasi padsa suhu 37°C selama 24 - 48 jam, maka didapatkan hasil sebagai berikut:

Perhitungan

Koefisien fenol adalah hasil bagi dari faktor pengenceran tertinggi desinfektan dengan faktor pengenceran tertinggi baku fenol yang masing-masing dapat membunuh bakteri uji dalam jangka waktu 10 menit, tetapi tidak membunuh dalam jangka waktu 5 menit.


Pembahasan

Dari pengamatan praktikum kali ini didapatkan hasil tes fenol 1:80, suatu desinfektan dengan konsentrasi 1:80, 1:100, dan 1:150. Tes fenol dengan pengenceran 1:80 pada tabel di atas menunjukkan bahwa kuman masih hidup sampai menit ke-10 namun setelah 15 menit, kuman tersebut mati. Hal ini cukup rasional oleh karena semakin lama fenol tersebut bekerja, semakin efektif pula daya disinfeksinya.

Pada pengenceran suatu desinfektan 1:80, tidak terdapat kuman sama sekali dari menit ke-5 sampai menit ke-15. Dengan hasil tersebut, asumsi kami adalah desinfektan ini memiliki kefektifitasan yang cukup bagus sehingga dapat langsung membunuh kuman dengan cepat.

Sementara pada pengenceran 1:100, tabung reaksi juga tidak menampakkan kekeruhan dan disimpulkan bahwa tidak ada bakteri yang hidup.

Namun pada pengenceran desinfektan yang terakhir, yaitu 1:150, terdapat kekeruhan di menit ke-5 tetapi tidak pada menit ke-10 dan ke-15. Kekeruhan pada pengenceran terakhir ini menimbulkan keraguan pada hasil dari pengenceran 1:100, atau pada pengenceran 1:150 ini.

Oleh karena kesalahan yang kami lakukan pada praktikum ini, kita tidak dapat melakukan perhitungan koefisien fenol.Terjadinya hal ini dapat diakibatkan oleh berbagai faktor kemungkinan. Faktor-faktor kemungkinan penyebab terjadinya kesalahan kami antara lain adalah:

* Pengerjaan praktikum secara paralel

Kegagalan yang terjadi dalam praktikum ini mungkin juga disebabkan oleh pengerjaan tabung Uji Disinfektan secara paralel yang saat itu dimaksudkan untuk mempersingkat waktu pengerjaan. Pengerjaan secara paralel tersebut telah mengakibatkan ketidakakuratan dan ketidaktelitian perhitungan waktu yang diperlukan.

* Ketidakakuratan dalam pengambilan kuman menggunakan ose

Dalam menginokulasi kuman uji terhadap desinfektan, kami memindahkan kuman tersebut hanya dengan 1 ose. Dengan penggunaan ose, terdapat kemungkinan kuman tidak terangkat sesuai dengan konsentrasi yang diinginkan. Sebab pada percobaan kami, banyak kuman yang mati. Pengambilan kuman dengan 2 ose mungkin dapat lebih akurat.

* Penggunaan spiritus yang berlebihan

Banyaknya kuman yang mati juga dapat disebabkan terlalu seringnya dilakukan flambir pada pembuatan inokulum dan pada penginokulasian kuman uji terhadap desinfektan. Kuman S. aureus dan S. thyphosa tumbuh optimum pada suhu 37°C, oleh karena itu tidak diperlukan suhu panas yang berlebihan.

* Pengenceran desinfektan yang tidak akurat

Pada percobaan kali ini, kami mungkin juga melakukan kesalahan ketika melakukan pengenceran desinfektan ke dalam 1:80, 1:100, 1:150. Pengenceran yang dilakukan tidak akurat, yaitu terlalu banyak desinfektan yang terkandung dalam 1:80 atau 1:100, sehingga desinfektan terlalu pekat dan tidak sebanding dengan jumlah kuman yang dibiakkan.

Kesimpulan

Dari percobaan yang kami lakukan tidak dapat diambil kesimpulan karena tidak ditemukan hasil yang sesuai.

sumber : http://pharzone.com/blog/50-mikrobiologi/108-uji-koefisien-fenol.html

penutupan dan Liburan HMJ

Penutupan dan Liburan HMJ Analis 2010..

Pisah sambut

Lagi ngantri nih buat salam2an..
Success ya buat kk' tingkat yang sekarang udah jadi alumni...
jangan Lupakan Kampus tercinta..
hahaha...

buat panitia, terima kasih atas kerja sama...
kompak selalu...

buat angkatan XII analis, buat analis kedepan lebih baik dari sekarang, dan junjung tinggi sportifitas...
hahahaha...

Futsal Analis

tim futsal analis..